一、大腸菌群介紹
大腸菌群并非細菌學(xué)分類(lèi)命名，而是衛生細菌領(lǐng)域的用語(yǔ)，它不代表某一個(gè)或某一屬細菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細菌，這些細菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致，其定義為：需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。一般認為該菌群細菌可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。
大腸菌群分布較廣，在溫血動(dòng)物糞便和自然界廣泛存在。調查研究表明，大腸菌群細菌多存在于溫血動(dòng)物糞便、人類(lèi)經(jīng)?；顒?dòng)的場(chǎng)所以及有糞便污染的地方，人、畜糞便對外界環(huán)境的污染是大腸菌群在自然界存在的主要原因。糞便中多以典型大腸桿菌為主，而外界環(huán)境中則以大腸菌群其他型別較多。
大腸菌群是作為糞便污染指標菌提出來(lái)的，主要是以該菌群的檢出情況來(lái)表示食品中有否糞便污染。大腸菌群數的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大小。糞便是人類(lèi)腸道排泄物，其中有健康人糞便，也有腸道患者或帶菌者的糞便，所以糞便內除一般正常細菌外，同時(shí)也會(huì )有一些腸道致病菌存在(如沙門(mén)氏菌、志賀氏菌等)，因而食品中有糞便污染，則可以推測該食品中存在著(zhù)腸道致病菌污染的可能性，潛伏著(zhù)食物中毒和流行病的威脅，必須看作對人體健康具有潛在的危險性。
大腸菌群是評價(jià)食品衛生質(zhì)量的重要指標之一，目前已被國內外廣泛應用于食品衛生工作中。
二、大腸菌群檢驗方法：
由于大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細菌，即：需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。因此大腸菌群的檢測一般都是按照它的定義進(jìn)行。
目前國內采用的進(jìn)出口食品大腸菌群檢測方法主要有國家標準和原國家商檢局制訂的行業(yè)標準。兩個(gè)標準方法在檢測程序上略有不同。
(一)國家標準：國家標準采用三步法，即：乳糖發(fā)酵試驗、分離培養和證實(shí)試驗。
乳糖發(fā)酵試驗：樣品稀釋后，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。36±1℃培養48±2h，觀(guān)察是否產(chǎn)氣。
分離培養：將產(chǎn)氣發(fā)酵管培養物轉種于伊紅美藍瓊脂平板上，36±1℃培養18-24h，觀(guān)察菌落形態(tài)。
證實(shí)試驗：挑取平板上的可疑菌落，進(jìn)行革蘭氏染色觀(guān)察。同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管36±1℃培養24±2h，觀(guān)察產(chǎn)氣情況。
報告：根據證實(shí)為大腸桿菌陽(yáng)性的管數，查MPN表，報告每100ml(g)大腸菌群的MPN值。
具體操作參見(jiàn)GB4789.3-94 《中華人民共和國國家標準食品衛生微生物學(xué)檢驗 大腸菌群測定》
(二)原國家商檢局制訂的行業(yè)標準，等效采用美國FDA的標準方法，用于對出口食品中的大腸桿菌進(jìn)行檢測。本方法采用兩步法：
推測試驗：樣品稀釋后，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種三管LST肉湯。36±1℃培養48±2h，觀(guān)察是否產(chǎn)氣。
證實(shí)試驗：將產(chǎn)氣管培養物接種煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯管中，36±1℃培養48±2h，觀(guān)察是否產(chǎn)氣。以BGLB產(chǎn)氣為陽(yáng)性。查MPN表，報告每ml(g)樣品中大腸菌群的MPN值。
具體操作參見(jiàn)SN0169-92 《中華人民共和國進(jìn)出口商品檢驗行業(yè)標準出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗方法》
三、說(shuō)明：
1.MPN檢索表：
MPN 為最大可能數(Most Probable Number)的簡(jiǎn)稱(chēng)。這種方法，對樣品進(jìn)行連續系列進(jìn)行稀釋?zhuān)尤肱囵B基進(jìn)行培養，從規定的反應呈陽(yáng)性管數的出現率，用概率論來(lái)推算樣品中菌數最近似的數值。
MPN檢索表只給了三個(gè)稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內數字應相應降低或增加10倍。注意國家標準和行業(yè)標準中所附MPN表所用稀釋度是不同的，而且結果報告單位也不相同。
2.初發(fā)酵和證實(shí)試驗：
無(wú)論是國家標準的三步法還是行業(yè)標準的兩步法，都利用了乳糖發(fā)酵管進(jìn)行了兩次發(fā)酵試驗，培養基的配制略有不同，但都是為了證實(shí)培養物是否符合大腸菌群的定義，即“在37℃分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”。
初發(fā)酵陽(yáng)性管，不能肯定就是大腸菌群細菌，經(jīng)過(guò)證實(shí)試驗后，有時(shí)可能成為陰性。有數據表明，食品中大腸菌群檢驗步驟的符合率，初發(fā)酵與證實(shí)試驗相差較大。因此，在實(shí)際檢測工作中，證實(shí)試驗是必需的。
3.產(chǎn)氣量與倒管：
在乳糖發(fā)酵試驗工作中，經(jīng)?？梢钥吹皆诎l(fā)酵倒管內極微少的氣泡(有時(shí)比小米粒還小)，有時(shí)可以遇到在初發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。實(shí)驗表明，大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿(mǎn)氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問(wèn)時(shí)，可以用手輕輕打動(dòng)試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應作進(jìn)一步試驗。
4.挑選菌落：
國家標準中，需要對初發(fā)酵陽(yáng)性培養物接種伊紅美藍平板分離，對典型和可疑菌落進(jìn)行觀(guān)察和證實(shí)試驗。由于大腸菌群是一群細菌的總稱(chēng)，在平板大腸菌群菌落的色澤、形態(tài)等方面較大腸菌更為復雜和多樣，而且與大腸菌群的檢出率密切相關(guān)。國家標準方法規定伊紅美藍平板為分離培養基，在該平板上，大腸菌群菌落呈黑紫色有光澤或無(wú)光澤時(shí)，檢出率最高;紅色、粉紅色菌落檢出率較低。
另外，挑取菌落數與大腸菌群的檢出率有密切關(guān)系，只挑取一個(gè)菌落，由于機率問(wèn)題，尤其當菌落不典型時(shí)，很難避免假陰性的出現。所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如無(wú)典型菌落則應多挑幾個(gè)，以免出現假陰性。
5.抑菌劑：
大腸菌群檢驗中常用的抑菌劑有膽鹽、十二烷基硫酸鈉、洗衣粉、煌綠、龍膽紫、孔雀綠等。抑菌劑的主要作用是抑制其它雜菌，特別是革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(cháng)。
國家標準中乳糖膽鹽發(fā)酵管利用膽鹽作為抑菌劑，行業(yè)標準中LST肉湯利用十二烷基硫酸鈉作為抑菌劑，BGLB肉湯利用煌綠和膽鹽作為抑菌劑。
抑菌劑雖可抑制樣品中的一些雜菌，而有利于大腸菌群細菌的生長(cháng)和挑選，但對大腸菌群中的某些菌株有時(shí)也產(chǎn)生一些抑制作用。有些抑菌劑用量甚微，稱(chēng)量時(shí)稍有誤差，即可對抑菌作用產(chǎn)生影響，因此抑菌劑的添加應嚴格按照標準方法進(jìn)行。
