菌落總數的檢驗方法
一、菌落總數介紹：
菌落是指細菌在固體培養基上生長(cháng)繁殖而形成的能被肉眼識別的生長(cháng)物，它是由數以萬(wàn)計相同的細菌集合而成。當樣品被稀釋到一定程度，與培養基混合，在一定培養條件下，每個(gè)能夠生長(cháng)繁殖的細菌細胞都可以在平板上形成一個(gè)可見(jiàn)的菌落。
菌落總數就是指在一定條件下（如需氧情況、營(yíng)養條件、pH、培養溫度和時(shí)間等）每克（每毫升）檢樣所生長(cháng)出來(lái)的細菌菌落總數。按國家標準方法規定，即在需氧情況下，37℃培養48h，能在普通營(yíng)養瓊脂平板上生長(cháng)的細菌菌落總數，所以厭氧或微需氧菌、有特殊營(yíng)養要求的以及非嗜中溫的細菌，由于現有條件不能滿(mǎn)足其生理需求，故難以繁殖生長(cháng)。因此菌落總數并不表示實(shí)際中的所有細菌總數，菌落總數并不能區分其中細菌的種類(lèi)，所以有時(shí)被稱(chēng)為雜菌數，需氧菌數等。
菌落總數測定是用來(lái)判定食品被細菌污染的程度及衛生質(zhì)量，它反映食品在生產(chǎn)過(guò)程中是否符合衛生要求，以便對被檢樣品做出適當的衛生學(xué)評價(jià)。菌落總數的多少在一定程度上標志著(zhù)食品衛生質(zhì)量的優(yōu)劣。
二、檢驗方法
菌落總數的測定，一般將被檢樣品制成幾個(gè)不同的10倍遞增稀釋液，然后從每個(gè)稀釋液中分別取出1mL置于滅菌平皿中與營(yíng)養瓊脂培養基混合，在一定溫度下，培養一定時(shí)間后（一般為48小時(shí)），記錄每個(gè)平皿中形成的菌落數量，依據稀釋倍數，計算出每克（或每ml）原始樣品中所含細菌菌落總數。
基本操作一般包括：樣品的稀釋?zhuān)瓋A注平皿－－培養48小時(shí)－－計數報告。
國內外菌落總數測定方法基本一致，從檢樣處理、稀釋、傾注平皿到計數報告無(wú)何明顯不同，只是在某些具體要求方面稍有差別，如有的國家在樣品稀釋和傾注培養進(jìn)，對吸管內液體的流速，稀釋液的振蕩幅度、時(shí)間和次數以及放置時(shí)間等均作了比較具體的規定。
三、說(shuō)明
（一）樣品的處理和稀釋?zhuān)?/p>
1．操作方法：以無(wú)菌操作取檢樣25g（或25ml)，放于225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶?jì)龋ㄆ績(jì)阮A置適當數量的玻璃珠)或滅菌乳缽內，經(jīng)充分振要或研磨制成1：10的均勻稀釋液。
固體檢樣在加入稀釋液后，最好置滅菌均質(zhì)器中以8000~10000r/min的速度處理1min，制成1：10的均勻稀釋液。
用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內，振搖試管混合均勻，制成1：100的稀釋液。
另取1ml滅菌吸管，按上項操作順序，制10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次即換用1支1ml滅菌吸管。
2．無(wú)菌操作：操作中必須有“無(wú)菌操作”的概念，所用玻璃器皿必須是完全滅菌的，不得殘留有細菌或抑菌物質(zhì)。所用剪刀、鑷子等器具也必須進(jìn)行消毒處理。樣品如果有包裝，應用75%乙醇在包裝開(kāi)口處擦拭后取樣。
操作應當在超凈工作臺或經(jīng)過(guò)消毒處理的無(wú)菌室進(jìn)行。瓊脂平板在工作臺暴露15分鐘，每個(gè)平板不得超過(guò)15個(gè)菌落。
3．采樣的代表性：如系固體樣品，取樣時(shí)不應集中一點(diǎn)，宜多采幾個(gè)部位。固體樣品必須經(jīng)過(guò)均質(zhì)或研磨，液體樣品須經(jīng)過(guò)振搖，以獲得均勻稀釋液。
4．樣品稀釋誤差：為減少樣品稀釋誤差，在連續遞次稀釋時(shí)，每一稀釋液應充分振搖，使其均勻，同時(shí)每一稀釋度應更換一支吸管。
在進(jìn)行連續稀釋時(shí)，應將吸管內液體沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀釋液內，以免吸管外部粘附的檢液溶于其內。
為減少稀釋誤差，SN標準采用取10mL稀釋液，注入90mL緩沖液中。
5．稀釋液：樣品稀釋液主要是滅菌生理鹽水，有的采用磷酸鹽緩沖液（或0.1％蛋白胨水），后者對食品已受損傷的細菌細胞有一定的保護作用。如對含鹽量較高的食品（如醬油）進(jìn)行稀釋?zhuān)梢圆捎脺缇麴s水。
（二）傾注培養
1．操作方法：根據標準要求或對污染情況的估計，選擇2~3個(gè)適宜稀釋度，分別在制10倍遞增稀釋的同時(shí)，以吸取該稀釋度的吸管移取1ml稀釋液于滅菌平皿中，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。
將涼至46℃營(yíng)養瓊脂培養基注入平皿約15ml，并轉動(dòng)平皿，混合均勻。同時(shí)將營(yíng)養瓊脂培養基傾入加有1ml稀釋液（不含樣品）的滅菌平皿內作空白對照。
待瓊脂凝固后，翻轉平板，置36±1℃溫箱內培養48±2h，取出計算平板內菌落數目，乘以稀釋倍數，即得每克（每毫升）樣品所含菌落總數。
2．傾注用培養基應在46℃水浴內保溫，溫度過(guò)高會(huì )影響細菌生長(cháng)，過(guò)低瓊脂易于凝因而不能與菌液充分混勻。如無(wú)水浴，應以皮膚感受較熱而不燙為宜。
傾注培養基的量規定不一，從12~20ml不等，一般以15ml較為適宜，平板過(guò)厚可影響觀(guān)察，太薄又易于干裂。傾注時(shí)，培基底部如有沉淀物，應將底部棄去，以免與菌落混淆而影響計數觀(guān)察。
3．為使菌落能在平板上均勻分布，檢液加入平皿后，應盡快傾注培養基并旋轉混勻，可正反兩個(gè)方向旋轉，檢樣從開(kāi)始稀釋到傾注最后一個(gè)平皿所用時(shí)間不宜超過(guò)20min，以防止細菌有所死亡或繁殖。。
4．培養溫度一般為37℃（水產(chǎn)品的培養溫度，由于其生活環(huán)境水溫較低，故多采用30℃）。培養時(shí)間一般為48h，有些方法只要求24h的培養即可計數。培養箱應保持一定的濕度，瓊脂平板培養48h后，培養基失重不應超過(guò)15％。
5．為了避免食品中的微小顆?；蚺嗷械碾s質(zhì)與細菌菌落發(fā)生混淆，不易分辨，可同時(shí)作一稀釋液與瓊脂培基混合的平板，不經(jīng)培養，而于4℃環(huán)境中放置，以便計數時(shí)作對照觀(guān)察。
在某些場(chǎng)合，為了防止食品顆粒與菌落混淆不清，可在營(yíng)養瓊脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培養后菌落呈紅色，易于分別。
（三）計數和報告
1．操作方法：培養到時(shí)間后，計數每個(gè)平板上的菌落數?？捎萌庋塾^(guān)察，必要時(shí)用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落總數后，求出同稀釋度的各平板平均菌落數，計算處原始樣品中每克（或每ml）中的菌落數，進(jìn)行報告。
2．到達規定培養時(shí)間，應立即計數。如果不能立即計數，應將平板放置于0－4℃，但不得超過(guò)24h。
3．計數時(shí)應選取菌落數在30~300之間的平板（SN標準要求為25~250個(gè)菌落），若有二個(gè)稀釋度均在30~300之間時(shí)，按國家標準方法要求應以二者比值決定，比值小于或等于2取平均數，比值大于2則其較小數字（有的規定不考慮其比值大小，均以平均數報告）。
4．若所有稀釋度均不在計數區間。如均大于300，則取最高稀釋度的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。如均小于30，則以最低稀釋度的平均菌落數乘稀釋倍數報告之。如菌落數有的大于300，有的又小于30，但均不在30~300之間，則應以最接近300或30的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。如所有稀釋度均無(wú)菌落生長(cháng)，則應按小于1乘以最低稀釋倍數報告之。有的規定對上述幾種情況計算出的菌落數按估算值報告。
5．不同稀釋度的菌落數應與稀釋倍數成反比（同一稀釋度的二個(gè)平板的菌落數應基本接近），即稀釋倍數愈高菌落數愈少，稀釋倍數愈低菌落數愈多。如出現逆反現象，則應視為檢驗中的差錯（有的食品有時(shí)可能出現逆反現象，如酸性飲料等），不應作為檢樣計數報告的依據。
6．當平板上有鏈狀菌落生長(cháng)時(shí)，如呈鏈狀生長(cháng)的菌落之間無(wú)任何明顯界限，則應作為一個(gè)菌落計，如存在有幾條不同來(lái)源的鏈，則每條鏈均應按一個(gè)菌落計算，不要把鏈上生長(cháng)的每一個(gè)菌落分開(kāi)計數。如有片狀菌落生長(cháng)，該平板一般不宜采用，如片狀菌落不到平板一半，而另一半又分布均勻，則可以半個(gè)平板的菌落數乘2代表全平板的菌落數。
7．當計數平板內的菌落數過(guò)多（即所有稀釋度均大于300時(shí)），但分布很均勻，可取平板的一半或1/4計數。再乘以相應稀釋倍數作為該平板的菌落數。
8．菌落數的報告，按國家標準方法規定菌落數在1~100時(shí)，按實(shí)有數字報告，如大于100時(shí)，則報告前面兩位有效數字，第三位數按四舍五入計算。固體檢樣以克（g)為單位報告，液體檢樣以毫升（ml）為單位報告，表面涂擦則以平方厘米（cm2）報告。
